Диагностика моноклональной и поликлональной гаммапатии

Электрофорез белковых фракций является незаменимым инструментом для скрининга и диагностики злокачественных моно- и поликлональных гаммапатий, сопутствующих иммунопролиферативные заболеваниям.
Моноклональная гаммапатия — это сборное наименование целого класса заболеваний, при котором происходит патологическая секреция аномальных, измененных по химическому строению, молекулярной массе или иммунологическим свойствам иммуноглобулинов (гамма-глобулинов) одним клоном плазматических клеток или B-лимфоцитов. Эти иммуноглобулины затем нарушают функции тех или иных органов и систем, например, почек, что и приводит к развитию симптомов заболевания.

ПАРАПРОТЕИНЫ ИЛИ МОНОКЛОНАЛЬНЫЙ КОМПОНЕНТ (МС)

Парапротеины или моноклональный компонент (МС) – иммуноглобулины одного класса и/или одного типа или их фрагменты, которые синтезируются в избыточном количестве. Структура иммуноглобулинов (Ig) МС при этом не нарушена, но синтез Ig или их отдельных компонентов превосходит уровень физиологической потребности организма. Обнаружение МС является диагностическим признаком моноклональной гаммапатии.

Моноклональная гаммапатия — это сборное наименование целого класса заболеваний, при котором происходит патологическая секреция аномальных, измененных по химическому строению, молекулярной массе или иммунологическим свойствам иммуноглобулинов (гамма-глобулинов) одним клоном плазматических клеток или B-лимфоцитов. Эти иммуноглобулины затем нарушают функции тех или иных органов и систем, например, почек, что и приводит к развитию симптомов заболевания.
Моноклональные гаммапатии могут быть доброкачественными, когда клональная популяция клеток, секретирующих аномальные иммуноглобулины, не проявляет тенденций к неконтролируемому росту и размножению или к неконтролируемому увеличению продукции аномального белка. А могут быть и злокачественными, когда клональная популяция, производящая аномальный белок, склонна к постоянному неконтролируемому росту и размножению и как следствие к увеличению секреции этого белка.
К злокачественным моноклональным гаммапатиям относятся, например, такие заболевания, как макроглобулинемия Вальденстрема, болезнь легких цепей и др.

Диагноз моноклональной гаммапатии основан на обнаружении гомогенной М-полосы обычно в зоне ɣ-глобулинов при электрофорезе белковых фракций сыворотки крови или мочи. Тем не менее, достаточно часто М-полоса мигрирует от ɣ -глобулинов до альбумина. М-полоса (МС) может быть представлена целыми молекулами IgG, IgM, IgA, реже IgE, IgD; либо отдельными свободными легкими цепями (СЛЦ) – ƛ (лямбда) или ƙ (каппа), либо тяжелыми цепями. Класс и тип Ig или их компонентов в течение болезни не меняется.

Присутствие в сыворотке крови МС не всегда сопровождается появлением лишней полосы на электрофореграмме. В случае небольшой молекулярной массы они могут выделяться с мочой (димеры свободных легких цепей или белок Бенс-Джонса). На электрофореграмме МС может быть обнаружен в ƅ-ɑ2 – зоне, реже в зоне ɑ1-глобулинов.

Классификация МС

По иммунохимическим различиям:
1. МС, соответствующая гиперпродукции целых молекул (IgG, IgM, IgA, реже IgE, IgD). Характерно для миеломы.

2. МС из свободных легких цепей лямбда или каппа (никогда вместе): обнаруживаются в сыворотке либо незначительно, либо при образовании конгломератов между собой при почечной недостаточности (нарушена их фильтрация). Сочетается с гипогаммаглобулинемией и встречается почти исключительно при злокачественной миеломе СЛЦ.

3. МС из свободных тяжелых цепей ɑ, ɤ или µ. Болезнь тяжелых цепей – крайне редкая.

Классификация на клинических критериях:

1. МС, связанные со злокачественными образованиями:
- миеломы (IgG, IgA, СЛЦ).
- Болезнь Вандельстрема с МС, представленным IgM.
- болезнь Франклина (МС из тяжелых цепей ɑ, ɤ или µ).

2. Неспецифические МС (IgG, IgM, реже IgA):
- МС, появляющиеся при некоторых злокачественных и доброкачественных заболеваниях.
- Идиопатические МС (у пожилых людей, бессимптомно).

Скрининг моноклональных компонентов: последовательность лаб. исследований.

С целью выявления моноклональных Ig рекомендована следующая последовательность лабораторных исследований:

Исследование сыворотки крови Измерение содержания общего белка
Измерение концентрации иммуноглобулинов (иногда отдельных классов Ig)
Электрофорез для выявления моноклонального компонента.
Измерение концентрации моноклонального компонента.
Иммуноэлектрофорез или иммунофиксация.
Исследование мочи Измерение общего белка мочи.
Электрофорез для выявления белка Бенс-Джонса.
Иммуноэлектрофорез или иммунофиксация.
Дополнительные методы исследования СОЭ.
Биохимические: измерение концентрации кальция, исследование функции почек.
Измерение концентрации бета 2-микроглобулина.
Измерение концентрации СРБ.
Исследование на криоглобулины.

Требования к исследуемому материалу:
Для проведения электрофоретического исследования необходимо использовать сыворотку крови, поскольку присутствующий в плазме фибриноген образует полосу, как и МС. Не рекомендуется использовать предварительно замороженные образцы. Образцы мочи должны быть собраны и направлены для исследования одновременно с образцами крови.

Периодичность исследований на МС:
Если МС обнаруживается в образце, но нет клинических и биологических признаков, анализ на МС повторяется через 3 и 6 месяцев, а затем через год.

Необходимо учитывать клиническую информацию, чтобы лучше планировать лабораторные исследования, особенно в случаях, когда патологические белки выявляются с трудом (например, легкие цепи при миеломе).

Исследование сыворотки крови. Замечания.

Измерение концентрации белка: это основное, хоть и неспецифическое скрининговое исследование. Если у пациента нет заболеваний почек, наличие гиперпротеинемии или протеинурии указывает на наличие гаммапатии.

• При миеломе и болезни Вальденстрема общий уровень белка чаще всего резко повышен > 100 г/л. Хотя на ранних стадиях развития патологии уровень может быть нормальным или немного завышенным.
• При неспецифических моногаммапатиях содержание общего белка остается в норме.
• При болезни легких цепей общий белок снижается.

При измерении концентрации МС адекватным методом является количественный электрофорез с денситометрическим сканированием. Иммунохимические методы (радиальная иммунодиффузия, иммунотурбидиметрия, нефелометрия) наиболее подходят для количественной оценки поликлональной гаммапатии.

Определение соотношения между ƙ и ƛ свободными легкими цепями (СЛЦ) (ƙ/ƛ).
Измерение концентрации ƙ и ƛ СЛЦ позволяет выявлять избыточную продукцию СЛЦ и помогает в типировании моноклональных иммуноглобулинов, при низких концентрациях МС соотношение ƙ/ƛ может быть нормальным.

Электрофорез сыворотки крови. Примеры.

Необходимо различать ситуации подозрения на присутствие МС с гипергаммаглобулинемией и гипогаммаглобулинемией.

Гипергаммаглобулинемия.

Гипергаммаглобулинемия имеет поликлональный характер и связана с повышенным синтезом Ig разных классов и субклассов. На электрофореграмме проявляется как повышенное окрашивание всей гамма-зоны.

Профиль гипергаммаглобулинемии свойственен образцам сыворотки пациентов с острым воспалительным ответом, системной красной волчанкой и ревматоидным артритом, острым и хроническим гепатопатиям.

Например, при алкогольном циррозе наблюдается повышенный синтез поликлональных IgA, которые при ЭФ образуют «бета-гамма мостик» - слияние полос между ƅ2-зоной и зоной фибриногена:

При определенных иммунопролиферативных нарушениях наблюдается олигоклональный профиль ЭФ разделения белков сыворотки, вызванный снижением гетерогенности синтезируемых Ig разного класса и субклассов вследствие дисфункции В-клеток. Возможны следующие варианты олигоклонального профиля:
• Моноклональный тип, когда в процесс включен один клон, характеризуется одной полосой в области ɤ-глобулинов. При типировании эта полоса, как правило, оказывается тяжелыми или легкими цепями, относящимися к моноклональному Ig данного типа.
• Олигоклональный тип, когда выявляется более двух полос на фоне ɤ-глобулинов., которые относятся к трем основным типам Ig G, A и М.

Олигоклональный профиль

Олигоклональную гаммапатию необходимо дифференцировать от случаев, когда в сыворотке присутствуют моноклональные Ig из полимеризованных субъединиц или когда в избытке синтезируются СЛЦ, которые не выделяются с мочой из-за почечной недостаточности. Различить подобные случаи помогает предварительная обработка образца ƅ-меркаптоэтанолом. При наличии олигоклональной гаммапатии после обработки ƅ-меркаптоэтанолом количество полос остается таким же, как при иммунофиксации.

В сыворотке крови олигоклональная гаммапатия с помощью иммунофиксации обнаруживается при следующих иммунодефицитных состояниях:
• Врожденный комбинированный иммунодефицит у детей (редко).
• Вторичный иммунодефицит у пациентов с пересаженными органами, некоторыми формами рака и аутоиммунными заболеваниями, которым проводится иммуносупрессивная терапия.
• Вирусный иммунодефицит у больных СПИДом.

Гипогаммаглобулинемия вызвана сниженным синтезом Ig разных классов и субклассов, также носит поликлональный характер и проявляется заметно низким уровнем окрашивания гамма-зоны. Гипогаммаглобулинемия характерна при иммунопролиферативных нарушениях (например, иммунодефицитные состояния).

Гипогаммаглобулинемия.

Тем не менее, гипогаммаглобулинемия наблюдается у 10% пациентов с множественной моногаммапатией без обнаружения МС при ЭФ белков сыворотки. Гипогаммаглобулинемия характерна для 20% пациентов с первичным амилоидозом.
Поэтому каждый случай гипогаммаглобулинемии требует последующей идентификации иммунопролиферативных нарушений конкретных Ig с помощью иммунофиксации.

В некоторых случаях на электрофореграммах могут появляться полосы, которые имитируют МС, хотя таковым не являются.

Примеры имитации МС:

В зоне альфа-2 глобулинов:
• четкая полоса гаптоглобина в зоне альфа-2 глобулинов при выраженном воспалении. В отличие от миеломы при воспалении имеет место и гипер-альфа 1-глобулинемия.

• высокий уровень альфа-2 макроглобулина при нефротическом синдроме. Отличие от миеломы: синдром сочетается с гипопротеинемией.

В зоне бета-глобулинов:

• Ложная МС полоса в результате выраженного гемолиза эритроцитов и выхода гемоглобина.

• немоноклональная гипер-ƅ-глобулинемия может быть вызвана повышением уровня трансферрина (при анемии), С3-компонента комплемента при нарушениях липидного обмена.

В зоне гамма-глобулинов:

• ложная полоса МС, связанная с присутствием фибриногена, не полностью удаленного из сыворотки (присутствие в крови пациента антикоагулянтов).

Исследование мочи. Замечания

Измерение общего белка в моче: выявление выраженной протеинурии при отсутствии патологии почек указывает на наличие гаммапатии. Однако определение общего белка в моче не имеет решающего значения для диагностики и его необходимо сочетать с электрофоретическим исследованием спектра белков мочи.

Важным диагностическим признаком миеломы, когда МС в крови пациента выявить не удается, является наличие белка Бенс-Джонса в моче (димеры ƙ или ƛ свободных легких цепей иммуноглобулинов).

На электрофореграммах могут появляться полосы в зоне ƅ-глобулинов, которые ошибочно можно принять за МС:
• гемоглобинонурия и миоглобинонурия могут симулировать белок Бенс-Джонса. Но при этом розоватое окрашивание мочи видно невооруженным глазом.
• ƙ и ƛ поликлональные свободные цепи могут появляться в моче при тубулярной протеинурии. В этом случае в моче присутствуют оба типа свободных легких
цепей в низких концентрациях, а на электрофореграмме белков мочи в зоне бета-глобулинов обнаруживается диффузная полоса.
При наличии белка Бенс-Джонса в моче должна быть компактная четкая полоса. На рис. примеры подозрения на присутствие белка Бенс-Джонса, образцы 2 / 6 / 12.
Образец 5 – диффузная полоса соответствует трансферрину.

Поликлональные свободные легкие цепи (поли-СЛЦ) обнаруживаются в моче условно здоровых пациентов. Ниже таблица отражает уровни ежедневной экскреции поли-СЛЦ:

Поли-СЛЦ ƙ Поли-СЛЦ ƛ
3,1 мг/24 часа (от 1,9 до 7,1) 1,5 мг/24 часа (от 0,7 до 3,4)
Отношение ƙ / ƛ = 2,4 (от 1,2 до 3,7)

Данные экскреции поли-СЛЦ у пациентов без миеломных патологий с протеинурией
250 мг/24 часа:

Поли-СЛЦ ƙ Поли-СЛЦ ƛ
45 мг/24 часа (от 3,8 до 211) 35 мг/24 часа (от 12 до 59)
Отношение ƙ / ƛ = 1,3 (от 0,25 до 3,4)

Белок Бенс-Джонса в моче представлен интактной моноклональной свободной легкой цепью ƙ или ƛ, неполными цепями, фрагментами или полимерами. Поэтому его формы имеют разный молекулярный вес и могут быть представлены мономерами, димерами, триммерами и тетрамерами в силу полимеризации и иметь несколько полос на электрофореграмме.

B.J. белок MW (Da)
Мономер 25 000
Димер 50 000
Тример 75 000
Тетрамер 100 000
Фрагменты < 25 000

Клинические показания необходимости исследовать наличие протеинурии Бенс-Джонса:

1) необходимость разделить бессимптомные гаммапатии от миеломы;
2) при подозрении на заболевание, вызванное протеинурией Бенс-Джонса;
3) при всех радиографических исследований с использованием или в отсутствии контрастирующей ионной жидкости.

Патологии, связанные с Бенс-Джонс протеинурией:

• Множественная миелома.
• Макроглобулинемия Вальденстрема.
• Амилоидоз.
• Болезнь отложения легких цепей.

Клинические проявления, обусловленные белком Бенс-Джонса:

• Нарушения функций почек из-за наличия миеломы.
• Амилоидоз.
• Болезнь отложения легких цепей.
• Синдром нарушения ренальной тубулярной функции.

Последовательность лабораторного исследования моноклональной гаммапатии в сыворотке и моче с привлечением исследования на белок Бенс-Джонса:

1. Наличие гомогенной полосы в области ɤ-глобулинов при разгонке белков сыворотки характеризует наиболее вероятный диагноз моноклональной гаммапатии, который требует типирования МС методом иммунофиксации.

2. Отсутствие МС на электрофореграмме белков сыворотки в сочетании с гипогаммаглобулинемией и отсутствием признаков почечной недостаточности требует электрофоретический анализ белков мочи на обнаружение белка Бенс-Джонса:

Ложный диагноз на моноклональную гаммапатию в образцах белков сыворотки при гипогаммаглобулинемии в сочетании с нефротическим синдромом хорошо дифференцируется, поскольку при нефротическом синдроме наблюдается гипоальбуминемия и заметно повышенный синтез ɑ2-макроглобулина и ƅ-липопротеина.

Если гипогаммаглобулинемия обнаруживается у взрослых людей и, в особенности, у людей старшего поколения, следует предположить наличие иммунопролиферативных нарушений. В таких случаях необходимо обратить особое внимание клинициста на наличие вероятных осложнений, обусловленных амилоидозом или заболеванием отложения легких цепей.

Дополнительные исследования, необходимые для диагностики белка Бенс-Джонса:

Измерение СОЭ: - показатель дисбаланса белков. Обычно СОЭ повышается при злокачественных гаммапатиях (>100 мм в первый час). Однако этот тест не является специфичным и изменения могут быть обнаружены при воспалительных заболеваниях или значительной поликлональной гаммапатии. В то же время, нормальные показатели СОЭ имеют место при миеломе СЛЦ, несекреторной миеломе, при криоглобулиновой природе моноклональных иммуноглобулинов.

Биохимические тесты:
• измерение кальция в крови и моче, поскольку при миеломе часто наблюдается повреждение костей, то выявляется гиперкальциемия и гиперкальциурия.
• полное лаб. обследование функции почек, при котором можно обнаружить гиперкреатинемию, если у пациента уже развилась почечная недостаточность.

Измерение концентрации ƅ2-микроглобулина. При интерпретации повышения уровня ƅ2-микроглобулина, который является маркером пролиферации лимфо(плазма)цитов, необходимо учитывать состояние функции почек. Уровень ƅ2-микроглобулина определяют при мониторинге лечения миеломы, поскольку его содержание зависит от размеров опухоли.

Измерение концентрации С-реактивного белка. Опухолевая ткань множественной миеломы вырабатывает ИЛ-6, стимулирующий синтез СРБ, уровень которого является надежным критерием эффективности лечения.

Клиническое значение обнаружения МС в сыворотке крови и моче.

Обнаружение моноклонального компонента или МС в сыворотке крови или моче свидетельствует о наличии той или иной формы следующих заболеваний:
А) Бессимптомные или пресимптоматические формы, клинически неопределенные:

Неспецифические моноклональные гаммапатии:
• Хроническое воспаление и инфекционные процессы, в том числе остеомиелит, туберкулез, хронические желчные инфекции, пиелонефрит, ревматоидный артрит и др.
• Саркома капоши и СПИД.
• Неретикулярная неоплазия, в особенности интенстинальная, рак легких и желчь выводящих путей; липодистрофия, особенно болезнь Гаучера, наследственная гиперхолестеринемия и ксантоматоз.

Преходящие моноклональные гаммапатии, связанные с:
• Гиперчувствительностью к наркотикам, дифенилгидантоину и сульфамидам.
• Вирусными инфекциями.
• Кардиохирургией, в том числе протезирование сосудов.

Б) Клинически установленные формы, связанные с неопластической клональной пролиферацией:

• Множественная миелома.
• Солитарная миелома.
• Экстрамедуллярная плазмоцитома.
• Плазмацеллюлярная лейкемия.
• Макроглобулинемия Вальденстрема.
• Болезнь тяжелых цепей.
• Болезнь ɑ-тяжелых цепей.
• Болезнь µ-тяжелых цепей.
• Болезнь делеции H и L цепей.

В) Клинически установленные формы, обусловленные патологическими эффектами моноклональных компонентов:

• Амилоидоз.
• Болезнь отложения иммуноглобулинов или их цепей.
• Папулезный муциноз.
• Синдром Фалькони.
• Полинейропатии.
• POEMS синдром (от английского Polyneuropathy, Organomegaly, Endocrinopathy, Monoclonal protein, Skin changes).
• SCLS синдром (от английского systemic capillary leak syndrome).

Критерии различия между неспецифическими гаммапатиями и множественной миеломой.

Критерий Неспецифические гаммапатии Множественная миелома
Прогрессирование Отсутствует наличие
Нарушения костной ткани Отсутствует Очень общего характера
Протеинурия Бенс-Джонса Отсутствует или < 200 мг/дл Присутствует примерно у 50%
Медуллярный плазмоцитоз Обычно < 20% > 20%
Индекс проявления < 1% > 3%
Интраплазмацеллюлярная активность кислой фосфатазы Отрицательная Выраженно положительная
Концентрация МС в сыворотке (IgG, IgA) Обычно < 30 г/л Обычно > 30 г/л
Концентрация поликлональных Ig Нормальная Сниженная
Тест на кальцитонин-индуцированную гипокальциемию Отрицательный Положительный

Как видно из таблицы, обнаружение МС не является фактом наличия злокачественных изменений.
В действительности, только менее чем у 20% пациентов с неспецифическими моноклональными гаммапатиями развивается множественная миелома, амилоидоз или лимфома даже по истечении более 10 лет наблюдения.
Критерии, указанные в таблице, носят ориентировочный характер.

Список литературы:

1. О.П. Шевченко, В.В. Долгов, Г.А. Олефиренко Электрофорез в клинической практике, 2008.
2. Andrea Ciapini and INTERLAB scientific team Protein electrophoresis and immunofixation: from laboratory to clinical practice.
3. Andrea Ciapini Atlante Di Quadri Proteici Elettroforetici Ed Immunofissativi Di Siero Proteine, Proteine Urinarie E Crioglobuline

Краткая справка

(Составитель Фунт В.А., к.б.н.)

Официальный дилер компании “INTERLAB” (Италия) в России

ООО «КОРМЕЙ РУСЛАНД»
127410, г. Москва, Алтуфьевское шоссе, д.41А, офис 52.
Тел./факс: (495) 221-58-49. Е-mail: cormay@cormay.ru, www.cormay.ru